脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种由运动神经元存活基因1（ Survival Motor Neuron 1，SMN1）的双等位基因失功能突变导致脊髓前角运动神经元退化变性的常染色体隐性遗传病，具有高致死致残的特点，未经治疗和干预的患儿约50%在2岁前死亡。随着基因治疗药物上市并纳入我国医保，早期精准基因诊断将能保障SMA患儿的临床诊治和疾病管理。

SMN1是SMA的致病基因，和SMN2基因均位于5q13高度复杂的基因组区域，两者易于发生重组，导致两个基因出现各种类型的拷贝数变异。同时，SMN1和SMN2基因具有99.9%的序列同源性，基于短读长的NGS技术难以精准区分。目前，SMA国际国内诊断指南均建议采用多种组合的方法进行SMA基因检测的策略：首先通过MLPA或定量PCR检测SMN1和SMN2的拷贝数，以确认SMA纯合缺失患者；如果临床疑似SMA患者仅存在SMN1杂合缺失时，再利用SMN1等位基因特异性长片段PCR结合巢式PCR（AS-LR-PCR）技术进一步检测SNV/indel。传统的SMN基因检测方法的靶点均为SMN1和SMN2外显子7上的c.840碱基，而并非完整的SMN基因。而SMN1基因SNV/indel的检测通常较耗时、不够精准，也无法检测出大片段的基因缺失。2023年12月27日，首都儿科研究所遗传室宋昉研究团队联合贝瑞基因生物技术公司在Clinica Chimica Acta杂志在线发表了题为A High-fidelity Long-read sequencing-based Approach Enables Accurate and Effective Genetic Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy的研究论文。该项研究在宋昉团队十余年积累的SMA基因数据库的基础上，建立和改进了三代单分子实时测序技术（LRS），使得SMA疾病的遗传检测能力得到全面提升，实现了对各种SMA基因型的精准分析，包括SMN1和SMN2基因拷贝数、基因序列和结构变异，并能发现2+0携带者。该研究报道了迄今为止最丰富的SMN1变异图谱，将会大力推进SMA患者诊断、新生儿筛查和携带者筛查。

在这项研究中，我们对来自67个家系的202个样本进行LRS检测，并与SMA传统方法检测结果进行比较。结果提示，LRS对SMN1和SMN2 拷贝数检测的准确率可达100%（202/202）和99.5%（201/202）。该方法纠正2例在MLPA拷贝数检测中由于探针结合区SNV/indels引起的SMN1基因拷贝数偏移。LRS成功鉴定出分布在全SMN1基因的23种致病性/可能致病性的SNV/indels，以及一些特殊的SMN1变异：呈反式构型的双等位基因变异-c.22dup和c.884A>T、新发变异-c.41_42delinsC、SMN1基因大片段缺失（8978bp缺失和1415bp缺失）及其确切断点； 还检测出SMN2基因变异c.346A>G和影响SMA表型的位于SMN2内含子的SNPs。另外，基于Trio-单倍型的系谱分析，LRS可以明确SMN1 2+0携带者，并确定SMN1和SMN2基因在两条染色体上的分布情况。

本研究提示，升级版LRS可同步分析SMN1和SMN2拷贝数、基因序列和结构变异，有助于SMA患者早期基因诊断和新生儿筛查；除了常见的1+0携带者外，LRS可对SMN1 1+1^d和2+0进行全面的携带者筛查。LRS使SMA的基因诊断从分步的位点检测提升到一步的全基因检测，是一种更全面和准确的诊断方法，有利于SMA患儿的早期诊疗和疾病管理。

图1. LRS一步实验同时检测SMN1和SMN2的拷贝数以及SNV/indel。IGV显示SE45P和SE53P两个病例的SMN1和SMN2的拷贝数均为1:2，纠正了SE45P和SE53P分别携带的c.835-17_835-14del和c.835-17C>G两种变异对既往应用PCR为基础的检测技术（MLPA/qPCR等）导致的SMN1基因拷贝数的偏移。

图2. LRS证实SE47P病例的SMN1和SMN2的拷贝数为2：2，其2个SMN1基因存在呈反式构型的致病性变异（c.22dup和c.884A>T），分别遗传自父亲和母亲。双SNV/indel导致的SMA非常罕见。

图3. LRS证实SE27P病例在唯一的SMN1基因发生了未报道的新发变异（c.41-42dellinsC）。SMN1新发的SNV/indel迄今尚未见到报道。

图4. LRS证实SE62家系成员携带了一个SMN2基因的未报道的错义变异c.346A>G。

图5. LRS证实SE50P和SE52P两个病例分别存在SMN1基因1415bp缺失（chr5:70924798-70926212）和8978bp缺失（chr5:70936243-70945220）。前者导致SMN1上游调控区和外显子1的缺失，后者导致外显子2a-5的缺失。分析证实SMN1两种大片段缺失均由Alu序列重组所致。

图6. LRS在SE55和SE48两个家系明确了罕见的SMA 2+0和1+1^d携带者组合，以及SMN1和SMN2单体型在每条染色体上的分布和上下代传递。

白晋丽副研究员和瞿宇晋研究员为论文第一作者/共同第一作者，宋昉研究员为论文第一通讯作者，首都儿科研究所为第一完成单位。该项目获得国家重点研发项目（2016YFC0901505）；首都儿科研究所横向课题（HX-2022-29）；国家自然科学基金（81501850）；北京市自然科学基金（7212005, L212035）; 首都儿科研究所方向性引导基金（JCYJ-2023-03）的资助。